وسترن بلات(گاهی اوقات نامیده می شود پروتئین ایمونوبلات) یک روش تحلیلی پرکاربرد است که در زیست شناسی مولکولی ، ایمونوژنتیک و سایر موارد استفاده می شود زیست شناسی مولکولیرشته هایی برای تعیین پروتئین های خاص در یک نمونه همگن یا عصاره بافت.
به طور خلاصه ، نمونه تحت تغییرپذیری پروتئین قرار می گیرد و پس از آن الکتروفورز ژل انجام می شود. یک آنتی بادی مصنوعی یا مشتق شده از حیوانات (که به عنوان یک آنتی بادی اولیه شناخته می شود) که ایجاد می شود ، پروتئین هدف خاصی را می شناسد و به آن متصل می شود. با الکتروفورز ، غشاء قبل از شستن آنتی بادی اضافی در محلول حاوی آنتی بادی اولیه شسته می شود. یک آنتی بادی ثانویه اضافه می شود که آنتی بادی اولیه را تشخیص داده و به آن متصل می شود. آنتی بادی ثانویه با استفاده از تکنیک های مختلف مانند رنگ آمیزی ، ایمونوفلورسانس و رادیواکتیویته تجسم شد که امکان تشخیص غیر مستقیم پروتئین هدف خاص را فراهم می آورد.
سایر روش های مرتبط شامل تجزیه و تحلیل نقطه لکه ، تجزیه و تحلیل کمی نقطه نقطه ، ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی است ، که در آن از آنتی بادی ها برای تشخیص پروتئین ها در بافت ها و سلول های دارای برچسب ایمنی استفاده می شود و روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA).
نام وسترن بلاتیک بازی با نامی جنوبی - بلات ، یک تکنیک تشخیص DNA است که قبلاً توسط ادوین ساوتن توسعه یافته بود. علاوه بر این ، تشخیص RNA لکه شمالی نامیده می شود و توسط جیمز الواین ، دیوید کمپ و جورج استارک در استنفورد توسعه داده شده است. اصطلاح "وسترن بلات" در این تکنیک توسط W. Neil Burnett ارائه شد ، اگرچه خود این روش در آزمایشگاه هری توبین ایجاد شد.
برنامه های کاربردی
وسترن بلات به طور گسترده ای در بیوشیمی برای تعیین کیفی تک پروتئین ها و اصلاح پروتئین (به عنوان مثال ، اصلاح پس از ترجمه) استفاده می شود. به عنوان یک روش کلی برای تعیین وجود یک پروتئین خاص در مخلوط پیچیده پروتئین ها استفاده می شود. نمره پروتئین نیمه کمی را می توان از اندازه و شدت رنگ نوار پروتئینی روی غشای لکه بدست آورد. علاوه بر این ، استفاده از یک سری رقیق کننده های پروتئین خالص با غلظت های شناخته شده می تواند برای برآورد دقیق تر غلظت پروتئین مورد استفاده قرار گیرد. وسترن بلات معمولاً برای بررسی تولید پروتئین پس از شبیه سازی استفاده می شود. همچنین در تشخیص های پزشکی مانند آزمایش HIV یا BSE-TEST استفاده می شود.
در آزمایش تأیید HIV از وسترن بلات برای تشخیص آنتی بادی های ضد HIV در انسان در سرم نمونه استفاده می شود. پروتئینهای سلولهای شناخته شده آلوده به HIV جدا شده و مطابق توضیحات فوق روی غشاء اعمال می شوند. سپس از سرم آزمایش در مرحله انکوباسیون آنتی بادی اولیه استفاده می شود. آنتی بادی رایگان شسته می شود و آنتی بادی ثانویه ضد انسانی متصل به سیگنال آنزیم اضافه می شود. سپس نوارهای رنگی پروتئین هایی را نشان می دهند که سرم بیمار حاوی آنتی بادی است.
وسترن بلات همچنین به عنوان یک آزمایش قطعی برای Creutzfeldt-Jakob ، نوعی بیماری پریون در ارتباط با مصرف گوشت گاو آلوده از گاوهای انسفالوپاتی اسفنجی شکل (BSE) گاو استفاده می شود.
کاربرد دیگر در تشخیص تولارمی است. ارزیابی توانایی وسترن بلات در تشخیص آنتی بادی علیه F. tularensis نشان داد که حساسیت آن تقریباً 100٪ و ویژگی آن 99.6٪ است.
تشخیص رنگ سنجی
روش تشخیص رنگ سنجی متشکل از انکوباسیون وسترن بلات با بستری است که با یک آنزیم گزارشگر (به عنوان مثال پراکسیداز) که به یک آنتی بادی ثانویه متصل است ، در تعامل است. این رنگ محلول را به شکل نامحلول با رنگ متفاوت تبدیل می کند که در کنار آنزیم رسوب می کند و در نتیجه غشا را رنگ می کند. سپس با شستشوی رنگ محلول ، توسعه لکه متوقف می شود. سطح پروتئین با استفاده از تراکم سنجی (به عنوان نقطه شدید) یا اسپکتروفتومتری ارزیابی شد.
تشخیص شیمی نوری
روشهای تشخیص شیمی نوری بستگی به جوجه کشی وسترن بلات با یک بستر دارد که وقتی خبرنگار در معرض آنتی بادی ثانویه قرار می گیرد ، روشن می شود. سپس نور توسط دوربین های CCD تشخیص داده می شود که تصاویر دیجیتالی را در وسترن بلات یا فیلم عکاسی ضبط می کند. استفاده از فیلم برای تشخیص وسترن بلات به دلیل فقدان خطی بودن تصویر (نه کمی دقیق) به تدریج از بین می رود. تصویر با استفاده از تراکم سنجی تجزیه و تحلیل می شود که مقدار نسبی رنگ آمیزی پروتئین را ارزیابی کرده و نتایج را از نظر چگالی نوری تعیین می کند. نرم افزار زیر در صورت استفاده از استانداردهای مناسب ، تجزیه و تحلیل داده های بیشتری مانند تجزیه وزن مولکولی را امکان پذیر می کند.
و در سایر رشته های علوم طبیعی.
روشهای مشابه دیگر از آنتی بادی ها برای تشخیص پروتئین ها در بافتها و سلولها از طریق رنگ آمیزی ایمونوسیت و روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) استفاده می کنند. الیزا).
وسترن بلات در آزمایشگاه جورج استارک ایجاد شد. جورج استارک) در استنفورد نام وسترن بلات توسط W. Neil Burnett به این تکنیک داده شده است. W. Neal Burnette) و بازی بر روی کلمات از نام Southern blotting است ، یک تکنیک تعیین DNA که قبلاً توسط ادوین ساوتن توسعه یافته بود. یک روش مشابه برای تعیین RNA لکه شمالی نامیده می شود ، تشخیص تغییرات پروتئینی پس از ترجمه را بلات شرقی می نامند. لکه شرقی).
آماده سازی نمونه
نمونه را می توان از بافت کامل یا از کشت سلولی برداشت. در بیشتر موارد، بافت سختابتدا با استفاده از مخلوط کن (برای حجم نمونه های بزرگ) ، با استفاده از هموژنایزر (حجم های کمتر) یا فراصوت به صورت مکانیکی آسیاب می شوند. در عین حال ، باکتری ها ، ویروس ها و سایر اجزای محیط نیز منبع پروتئین هستند.
الکتروفورز ژل
پروتئین ها با الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید جدا می شوند. جداسازی پروتئین ها را می توان با نقطه ایزوالکتریک (pI) ، وزن مولکولی ، بار الکتریکی یا ترکیبی از این پارامترها انجام داد.
متداول ترین روش برای جداسازی پروتئین ها الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات (rus. SDS) با توجه به Laemmli. SDS پروتئین ها را خنثی می کند و آنها را در حالت دناتوره نگه می دارد ؛ عوامل کاهنده پیوند دی سولفید ، برای مثال دیتیوتریتول و مرکاپتو اتانول ، برای از بین بردن ساختارهای ثانویه و سوم پروتئین ها استفاده می شوند. پلی پپتیدهای تغییر شکل یافته در یک میدان الکتریکی از طریق ژل آکریل آمید به آند مهاجرت می کنند ، در حالی که پروتئین های کوچکتر سریعتر حرکت می کنند و بنابراین با توجه به وزن مولکولی جدا می شوند. غلظت آکریل آمید وضوح ژل را تعیین می کند - هرچه غلظت آکریل آمید بیشتر باشد ، رزولوشن پروتئین های با وزن مولکولی پایین بهتر است. غلظت کم آکریل آمید وضوح پروتئین های با وزن مولکولی بالا را بهبود می بخشد. همچنین می توان از الکتروفورز دو بعدی (2-D) استفاده کرد. در این مورد ، جداسازی پروتئین ها در دو جهت انجام می شود - مطابق با نقطه ایزوالکتریک آنها در جهت اول ، و مطابق با وزن مولکولی آنها در جهت دوم.
نمونه های روی ژل روی جیب ها اعمال می شود. به عنوان یک قاعده ، یکی از "آهنگ" برای نشانگرها باقی می ماند وزن مولکولی(مخلوطی از پروتئین ها با توده های شناخته شده). پس از اعمال ولتاژ ، پروتئین ها در یک میدان الکتریکی با سرعت های مختلف حرکت می کنند. تفاوت در سرعت پیشرفت - تحرک الکتروفورتیک منجر به جداسازی پروتئین ها به نوار می شود (انگلیسی باندها).
انتقال به غشاء
برای در دسترس قرار دادن پروتئین ها برای آنتی بادی ها و تشخیص بیشتر ، آنها را به همراه یک نوار ژل به غشای ساخته شده از نیتروسلولز یا پلی وینیلیدن فلوراید منتقل می کند. PVDF) غشاء روی ژل قرار می گیرد و یک دسته کاغذ صافی در بالای آن قرار می گیرد. کل پشته در یک بافر انتقال قرار می گیرد ، که توسط نیروهای مویرگی کاغذ را به بالا هل می دهد و پروتئین ها را با خود حمل می کند. روش دیگر انتقال پروتئین ها نامیده می شود الکتروبوتینگو از یک جریان الکتریکی استفاده می کند که پروتئین ها را از ژل به غشاء منتقل می کند. پروتئین ها از ژل به سمت غشا حرکت می کنند در حالی که محل خود را حفظ می کنند. در نتیجه این "لکه گیری" (از انگلیسی. لکه گیری) ، پروتئین بر روی یک لایه سطحی نازک از غشا برای تشخیص نگهداری می شود. هر دو نوع غشاء به دلیل خاصیت اتصال پروتئین های غیر اختصاصی مورد استفاده قرار می گیرند. اتصال پروتئین هم بر اساس فعل و انفعالات آبگریز و هم برهم کنش های الکترواستاتیک بین غشا و پروتئین است. غشای نیتروسلولوز ارزان تر از PVDF است ، اما بسیار شکننده تر و در برابر برچسب زدن مجدد مقاوم تر است.
یکنواختی و کارایی کلی انتقال پروتئین ها از ژل به غشا را می توان با رنگ آمیزی غشاء با Coomassie blue یا Ponceau S. تأیید کرد. Coomassie شایع ترین این دو است ، در حالی که Ponceau S حساس تر و محلول تر در آب است ، شستشو و برچسب زدن غشا را آسان تر می کند. ...
مسدود کردن
هنگامی که یک غشاء به دلیل قابلیت اتصال به پروتئین ها انتخاب می شود ، آنتی بادی ها و پروتئین هدف انتخاب می شوند ، باید اقداماتی انجام شود تا تعامل بین غشا و آنتی بادی مورد استفاده برای تشخیص پروتئین مورد نظر حذف شود (زیرا آنتی بادی خود یک پروتئین است). مسدود کردن اتصال غیر اختصاصی با قرار دادن غشاء در محلول پروتئین رقیق - معمولاً آلبومین سرم گاو (BSA) یا شیر خشک بدون چربی (هر دو ارزان) ، با درصد کمی از مواد شوینده مانند Tween 20. به دست می آید. پروتئین محلول رقیق چسبیده است. به غشا در هر کجا که هدف چسبیده نیست. بنابراین ، هنگامی که آنتی بادی ها اضافه می شوند ، آنها (آنتی بادی ها) هیچ فضایی آزاد در غشای محل اتصال خود ندارند ، به جز محل اتصال به پروتئین های هدف خاص. این "نویز" پس زمینه در محصول نهایی وسترن بلات منجر به نتایج پاک و حذف مثبت کاذب می شود.
تشخیص
در طی فرایند تشخیص ، غشا با پروتئین مورد علاقه با یک آنتی بادی اصلاح شده "برچسب گذاری" می شود ، که به یک آنزیم گزارشگر متصل می شود ، که در یک بستر مناسب نگهداری می شود و منجر به واکنش رنگ سنجی و رنگ آمیزی می شود. به دلایل مختلف ، تشخیص در دو مرحله انجام می شود ، اگرچه در حال حاضر یک روش تشخیص یک مرحله ای برای برنامه های خاص در دسترس است.
آنتی بادی ها با عمل بر روی کلاس میزبان یا بر روی سلول های ایمنی با مقداری پروتئین (یا قسمتی از آن) تولید می شوند. معمولاً این بخشی از پاسخ ایمنی است ، اما در اینجا (در تجزیه و تحلیل) آنتی بادی های جمع آوری شده به عنوان یک خاص استفاده می شود. و ابزار تشخیص حساس که مستقیماً به پروتئین متصل می شود.
پس از انسداد ، محلول رقیق شده آنتی بادی اولیه (معمولاً بین 0.5 تا 5 میکروگرم بر میلی لیتر) با غشا انکوبه می شود و به آرامی تکان داده می شود. به طور معمول محلول شامل محلول نمک بافر با درصد کمی شوینده ، گاهی اوقات با شیر خشک یا BSA است. محلول و غشای آنتی بادی را می توان با هم بسته و در هر نقطه از 30 دقیقه تا یک شب انکوبه کرد. آنها همچنین می توانند در دماهای مختلف انکوبه شوند ، در دمای بالا اتصال بهتر مشاهده می شود - هم خاص (پروتئین هدف ، "سیگنال 1") و هم غیر اختصاصی ("سر و صدا").
پس از شستشو غشاء برای از بین بردن آنتی بادی های اولیه بدون پیوند ، غشاء در آنتی بادی های دیگر نگهداری می شود که مستقیماً به مناطق خاص کلاس آنتی بادی های اولیه متصل می شوند. آنها به عنوان آنتی بادی های ثانویه شناخته می شوند و با توجه به خواص مورد نظر خود ، معمولاً به عنوان ضد موش ، ضد بز و غیره شناخته می شوند. آنتی بادی ها از منبع حیوانی (یا منابع حیوانی کشت هیبریدوما) بدست می آیند. آنتی بادی های ثانویه ضد موش به اکثر آنتی بادی های اولیه مشتق از موش متصل می شوند. این امر با اجازه دادن به یک آزمایشگاه برای استفاده از یک منبع تولید انبوه آنتی بادی ، موجب صرفه جویی می شود و به نتایج قابل تکرار بیشتری منجر می شود. آنتی بادی های ثانویه معمولاً با بیوتین یا آنزیم گزارشگر مانند قلیایی فسفاتاز یا پراکسیداز ترب ترشح می شوند. این بدان معنی است که چندین آنتی بادی ثانویه می توانند به یک اولیه متصل شوند و سیگنال را تقویت کنند.
متداول ترین آنتی بادی های ثانویه مرتبط با پراکسیداز ترب کوهی برای برش عامل کمیلومینسانس استفاده می شود و محصول واکنش متناسب با مقدار پروتئین ، لومینسانس تولید می کند. یک ورقه فیلم عکاسی حساس به نور در برابر غشاء قرار می گیرد و در معرض تابش واکنش قرار می گیرد و تصویری از نوارهای آنتی بادی روی لکه ایجاد می کند. یک روش ارزان تر اما کمتر حساس با استفاده از رنگ آمیزی 4 کلرونفتول مخلوط با 1 per پراکسید هیدروژن. واکنش رادیکال پراکسید با 4-کلرونفتول رنگ قهوه ای تیره می دهد که بدون استفاده از فیلم عکاسی خاص ثبت می شود.
روش جایگزین سوم از برچسب رادیواکتیو به جای آنزیم مرتبط با آنتی بادی ثانویه مانند پروتئین متصل کننده آنتی بادی برچسب زده شده مانند پروتئین A استفاده می کند. استافیلوکوکبا ایزوتوپ رادیواکتیو ید. روشهای دیگر ایمن تر ، سریعتر و ارزان تر هستند ، بنابراین تشخیص رادیواکتیو به ندرت مورد استفاده قرار می گیرد.
از لحاظ تاریخی ، فرآیند برچسب زدن یک فرآیند دو مرحله ای بوده است زیرا تولید آنتی بادی های اولیه و ثانویه در فرآیندهای جداگانه نسبتاً آسان تر است. این مزایای انعطاف پذیری فوق العاده ای را در اختیار محققان و شرکت ها قرار می دهد و یک مرحله تقویت به فرایند تشخیص می افزاید. با ظهور تجزیه و تحلیل پروتئین با کارایی بالا و آستانه های تشخیص پایین ، هنوز علاقه ای به توسعه سیستم برچسب گذاری یک مرحله ای وجود دارد که به روند سریع تر و مقرون به صرفه تر ادامه می دهد. این (سیستم در یک مرحله) به برچسب های آنتی بادی احتیاج دارد که پروتئین مورد نظر را تشخیص داده و در عین حال یک نشانگر برای تشخیص داشته باشد-برچسب هایی که در دسترس ترین "دم های پروتئینی" هستند. برچسب ها ابتدا با یک غشای دو مرحله ای به روش آنتی بادی اولیه انکوبه می شوند و پس از یک سری شستشوها برای تشخیص مستقیم آماده می شوند.
تحلیل و بررسی
پس از شستن برچسب های بدون محدودیت ، وسترن بلات آماده تشخیص پروب هایی است که به پروتئین مورد نظر متصل شده اند. در عمل ، همه غربی ها پروتئین ها را تنها با یک باند روی غشا تشخیص نمی دهند. اندازه تقریبی با مقایسه نوارهای رنگ آمیزی شده با نشانگرهای وزن مولکولی اضافه شده توسط الکتروفورز محاسبه می شود. این فرآیند با پروتئین های ساختاری مانند اکتین یا توبولین تکرار می شود ، که بین آزمایشات تغییر نمی کند. میزان پروتئین هدف به میزان کنترل پروتئین ساختاری بین گروه ها بستگی دارد. این روش تصحیح مقدار پروتئین کل روی غشا را در صورت خطا یا انتقال ناقص فراهم می کند.
تشخیص رنگ سنجی
روش تشخیص رنگ سنجی بر اساس انکوباسیون وسترن بلات با بستری است که با آنزیم گزارشگر (مانند پراکسیداز ترب) واکنش نشان می دهد. پراکسیداز ترب کوهی) ، "نشسته" بر روی آنتی بادی ثانویه. رنگ محلول به شکل نامحلول با رنگ متفاوت تبدیل می شود و در نزدیک آنزیم رسوب کرده و غشا را رنگ می کند. با از بین بردن رنگ محلول ، رشد لکه محدود می شود. سطوح پروتئین به صورت تراکم سنجی با شدت رنگ یا طیف سنجی اندازه گیری می شود.
تشخیص شیمی نوری
روش تشخیص شیمی نوری بر اساس انکوباسیون غشای نیتروسلولز با بستری است که پس از تعامل با گزارشگر آنتی بادی ثانویه روشن می شود. نور توسط یک فیلم عکاسی یا دوربین CCD ثبت می شود که به صورت دیجیتالی وسترن لات را ثبت می کند. این تصویر به صورت چگالی سنجی مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد و مقدار نسبی پروتئین رنگ آمیزی شده را ارزیابی می کند و در واحدهای چگالی نوری نتیجه کمی می دهد. نرم افزار جدید امکان تجزیه و تحلیل بیشتر داده ها مانند تعیین وزن مولکولی را در صورت استفاده از استاندارد مناسب فراهم می کند.
تشخیص رادیواکتیو
برچسب های رادیواکتیو نیازی به بسترهای آنزیمی ندارند ، اما اجازه می دهند فیلم رادیوگرافی پزشکی در مقابل وسترن بلات قرار گیرد و به آن اجازه می دهد (فیلم) با برچسب ها تعامل داشته باشد و نواحی تیره متناسب با نوارهای پروتئین مورد مطالعه ایجاد کند (در تصویر سمت راست) تقاضا برای روشهای تشخیص رادیواکتیو به دلیل هزینه بالای آنها کاهش می یابد ، ریسک بالابرای سلامتی و ایمنی و جایگزین های ارائه شده توسط ECL.
تشخیص فلورسانس
برچسب های فلورسنت توسط نور برانگیخته می شوند و طول موج بلندتری را که توسط حسگرهای نوری مانند دوربین CCD مجهز به فیلترهای انتشار مناسب تشخیص داده می شود ، منتشر می کنند. این دوربین یک تصویر دیجیتالی از وسترن بلات می گیرد که به تجزیه و تحلیل بیشتر داده های بدست آمده مانند تجزیه و تحلیل وزن مولکولی و تجزیه و تحلیل کمی وسترن بلات کمک می کند.
لکه گیری(از انگلیسی " لکه" - نقطه) - انتقال NK ، پروتئین ها و لیپیدها به یک حمایت جامد ، به عنوان مثال ، غشاء ، و بی حرکت شدن آنها.
- الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید: o در شرایط تغییر رنگ با افزودن اوره - جداسازی NC های کوتاه تک رشته ای ؛
- تمرکز ایزوالکتریک - جدا کردن پروتئین ها توسط نقطه ایزوالکتریک (pI) ؛
- الکتروفورز دو بعدی (2 بعدی) - برای جداسازی پروتئین ها در دو جهت - با نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی.
- الکتروفورز ژل آگارز - جداسازی NA: o در طول قطعات خطی ؛
- کروماتوگرافی لایه نازک - جداسازی لیپیدها از کمپلکسهای چربی.
o در شرایط تغییر رنگ با افزودن سدیم دودسیل سولفات (الکتروفورز طبق Laemmli) - جداسازی پروتئین ها با وزن مولکولی ؛
o در شرایط بومی - جداسازی پروتئین ها با ساختار سه بعدی.
o با "فراپیچ" مولکولهای حلقه ؛
- انتشار مولکولها - انتقال آهسته ، اغلب برای لیپیدها استفاده می شود.
- لکه شدن مویرگ - غشا به ژل فشار داده می شود ، یک دسته کاغذ صافی روی آن قرار می گیرد ، بافر انتقال ژل را مرطوب می کند و تحت تأثیر نیروهای مویرگی بالا می رود ، کاغذ فیلتر را خیس می کند و ماکرومولکول ها را از ژل به ژل منتقل می کند. غشاء؛ لکه های مویرگی را می توان انجام داد: o در اتاقهایی با ژل مرطوب کننده با بافر - انتقال "نیمه خشک" ؛
- لکه خلاء - شبیه به لکه شدن مویرگی است ، اما انتقال با استفاده از خلاء به جای نیروهای مویرگی ایجاد شده توسط خیساندن کاغذ صافی تسریع می شود.
- لخته شدن الکتریکی - انتقال ماکرومولکول های باردار به غشا تحت تأثیر جریان الکتریکی اتفاق می افتد.
- "دوخت" NK به غشاء تحت تابش یا گرمایش UV - برای ثابت شدن نهایی روی غشاهای نایلونی ؛
- لکه گیری نقطه ای (لکه گیری شکاف) - نمونه به صورت نقطه یا خط مستقیم بر روی غشاء بدون جداسازی قبلی مولکولها در ژل یا صفحه TLC اعمال می شود.
o در محفظه هایی با غوطه ور شدن ژل در بافر ؛
- غشاهای PVDF (پلی وینیلیدن فلوراید) ؛
- غشای NC (نیتروسلولز) ؛
- غشاهای نایلونی (برای NK استفاده می شود).
- رنگ آمیزی - اتصال رنگ (یونهای نقره ، Coomassie ، Ponceau ، اتیدیوم برومید) به طور مستقیم با ماکرومولکولهای قابل تشخیص ؛
- برچسب زدن ایمونوشیمیایی - برچسب گذاری مولکولهای ماکرومولک به دلیل اتصال آنتی بادی های برچسب دار به طور خاص به آنها رخ می دهد ، تشخیص انجام می شود: o رنگ آمیزی ایمنی - آنتی بادی ها با رنگ برچسب گذاری می شوند ، جذب نور با طول موج مشخص ثبت می شود.
- برچسب زدن تابش - برچسب های تابش (رادیو ایزوتوپ) به ماکرومولکول ها وارد می شوند ، تشخیص با استفاده از موارد زیر انجام می شود: o اتورادیوگرافی (به غشای فیلم عکاسی تحمیل می شود) ؛
- هیبریداسیون - اتصال اسیدهای نوکلئیکالیگونوکلئوتیدهای دارای برچسب با ساختار مکمل ، تشخیص ، به عنوان یک قاعده ، با ثبت انتشار تابش یا فلورسانس برچسب انجام می شود.
- طیف سنجی جرمی - برای تجزیه و تحلیل ساختاری مستقیم لیپیدها استفاده می شود.
o ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم - آنتی بادی ها با یک آنزیم برچسب گذاری می شوند ، مقدار محصول رنگی تولید شده در طول واکنش آنزیمی (ELISA) ثبت می شود.
o chemiluminescent - آنتی بادی ها با یک آنزیم گزارشگر برچسب گذاری می شوند ، که در حضور یک سوبسترا ، درخشندگی ساطع می کند ، انتشار نور ثبت می شود
طول موج مشخص ؛
o فلورسنت - آنتی بادی ها با برچسب فلورسنت برچسب گذاری می شوند ، که توسط نور با طول موج مشخص برانگیخته می شود ، انتشار نور در
منطقه طول موج طولانی تر ؛
o تصویربرداری رادیویی (تعیین میزان انتشار تابش و ایجاد تصویر گرایش متقابلبرچسب ها) ؛
- لکه جنوبی(بلات جنوبی) - با نام ادوین ساوتن ، که روشی را پیشنهاد کرد - تعیین توالی DNA در نمونه و تعیین تعداد کپی ژن ها در DNA ژنومی. انتقال به غشاء قبل از هضم نمونه با اندونوکلئازهای محدود کننده به قطعات و تقسیم آنها توسط الکتروفورز در ژل آگارز انجام می شود. سنجش غشاء توسط هیبریداسیون با الیگونوکلئوتیدهای برچسب دار با توالی شناخته شده انجام می شود.
- لکه شمالی- تعیین توالی RNA در نمونه و مطالعه بیان ژن (تعیین mRNA). مشابه با لکه گیری جنوبی ، اما مولکولهای RNA جدا شده از نمونه ، بدون برش توسط اندونوکلئازها مورد بررسی قرار می گیرند. جداسازی مولکولها در یک ژل آگارز با افزودن فرمالدئید (برای تغییر رنگ RNA) یا در یک ژل پلی اکریل آمید با افزودن اوره (که برای تجزیه و تحلیل microRNA استفاده می شود) انجام می شود. بی حرکتی مولکولهای RNA بر روی غشا به دلیل گرم شدن در خلا یا "دوختن" با استفاده از تابش اشعه ماوراء بنفش رخ می دهد.
- وسترن بلات- پروتئین ایمنی - یک روش تحلیلی برای تعیین پروتئین های خاص در یک نمونه. انتقال به غشاء قبل از جداسازی پروتئین ها در ژل پلی اکریل آمید انجام می شود. تجزیه و تحلیل پروتئین ها بر روی غشاء ایمونوشیمیایی انجام می شود.
- وسترن لات چراغ جلو- لکه گیری پروتئین ، که برای تعیین برهمکنش پروتئین و پروتئین استفاده می شود ، مشابه وسترن بلات است ، اما به جای آنتی بادی ، پروتئین های دیگری استفاده می شود که به طور خاص به پروتئین مورد مطالعه متصل می شوند.
- کوآسترن بلات- تعیین پروتئین هایی که به DNA متصل می شوند و محل هایی در مولکول های DNA که پروتئین ها به آنها متصل می شوند - شبیه وسترن بلات است ، اما پس از تغییر شکل الکتروفورز در ژل پلی اکریل آمید ، پروتئین ها در حضور اوره از سدیم دودسیل سولفات شسته می شوند و به غشای نیتروسلولوز با انتشار قطعات DNA دارای برچسب به عنوان نمونه استفاده می شود. طول های مختلفبدست آمده از برش قطعه بزرگتر بررسی شده از DNA ژنومی. سپس مولکولهای DNA متصل شده از هر کمپلکس پروتئین-DNA شسته شده و با الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید تجزیه و تحلیل می شوند.
- لکه شرقی- تعیین تغییرات پس از ترجمه پروتئین ها (لیپیدهای مرتبط ، گلیکوپلی ساکاریدها ، بقایای فسفات) - مشابه وسترن بلات ، اما آنتی بادی ها نه برای پروتئین ها ، بلکه برای لیپیدها ، گلیکوپلی ساکاریدها و غیره استفاده می شود. همچنین ، علاوه بر آنتی بادی ها ، سایر مولکول های پروتئینی که به موارد مورد بررسی متصل می شوند (به عنوان مثال ، لکتین) به عنوان نمونه استفاده می شود.
- چراغ جلو-لکه شرقی- تجزیه و تحلیل لیپیدها با کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا جدا شده است. انتقال به غشا معمولاً با انتشار انجام می شود. ثبت با تجزیه و تحلیل ساختاری طیف سنجی جرمی مستقیم انجام می شود.
وسترن بلات
استاد گروه بیوشیمیو زیست شناسی مولکولی ،
دکتر مد اسپرینا لیودمیلا
ویکتوروونا
وسترن بلات
تعریف. وسترن بلات
(وسترن بلات ،
تحلیلی
روش،
استفاده برای
تعاریف
خاص
پروتئین های موجود در نمونه
تعریف. وسترن بلات (وسترن بلات ، پروتئین ایمونوبلات ، وسترن بلات)
تعریف. وسترن بلات(وسترن بلات ،
پروتئین ایمونوبلات ، وسترن بلات)
وسترن بلات در آزمایشگاه ایجاد شد
جورج استارک (استنفورد ، انگلستان)
نام وسترن بلات توسط این تکنیک توسط W.
نیل برنت و یک بازیگر جنسی از
نامگذاری بلات جنوبی (بلات جنوبی). روش تعیین DNA توسعه یافته است
قبلا توسط ادوین ساوتن
وسترن بلات در آزمایشگاه جورج استارک (استانفورد ، انگلستان) ایجاد شد
وسترن بلات -روش تعیین
پروتئین ها
تکنیک های بلات جنوبی
تعیین DNA ،
توسعه یافته
قبلا ادوین
جنوبی جنوبی
لکه گیری)
روشی مشابه
تعاریف RNA
شمالی نامیده می شود
لکه گیری (غیر
لکه گیری)
تشخیص
پس از ترجمه
اصلاح پروتئین
شرقی نامیده می شود
لکه گیری (شرقی
لکه گیری)
پروتکل پروتکل
پروتکل1. جداسازی پروتئین ها
توسط الکتروفورز ژل SDS-PAGE /
استفاده از الکتروفورز ژل
پروتئین ها به
ژل پلی اکریل آمید
2. انتقال پروتئین ها به
غشاء
3. مسدود کردن و تشخیص
سپس با آنها شناسایی می شوند
استفاده از آنتی بادی:
پروتئین ها ابتدا به آنها متصل می شوند
اولیه (تک یا
پلی کلونال) آنتی بادی ها ،
که به نوبه خود
مخاطب
با آنتی بادی های ثانویه ،
همراه با آنزیم ها
(پراکسیداز ترب کوهی یا
فسفاتاز قلیایی).
پروتکل وسترن بلات می تواند آنتی ژن را در مقادیر کمتر از 1 نانوگرم تشخیص دهد.
پروتکلوسترن بلات می تواند تشخیص دهد
مقدار آنتی ژن کمتر از 1ng.
4. تجسم.
درجه بالا
اجازه برای
حساب الکتروفورتیک
جداسازی پروتئین ها و
اختصاصی
آنتی بادی های مونوکلونال
تجسم
پروتئین مورد بررسی قرار گرفت
به دست امده توسط
برگزاری
متناظر
واکنش بیوشیمیایی با
تشکیل محصول ،
که تعیین می شود
رنگ سنج ، کم نور ،
روشهای فلورسنت
تشخیص
5. تجزیه و تحلیل.
مقدار پروتئین برآورد می شودبا استفاده از تراکم سنجی
این روش قطعات DNA منحصر به فردی را که تقریباً یک میلیونیم ژنوم هستند ، شناسایی می کند
DNA ژنومی (معمولاًجداشده از
لکوسیت ها یا سلول ها
میوه) تقسیم می شود
قطعات کوتاه ،
آنها را در آگارز جدا کنید
ژل ، منتقل شده به
غشاء ، پس از آن
شناسایی کنید
مناطق خاص با
توسط هیبریداسیون با
الیگونوکلئوتید
کاوشگرها
لاتین ناترین
آنالوگ بلات جنوبی.این روش به شما امکان می دهد موارد خاصی را شناسایی کنید
mRNA و اندازه آن را برآورد کنید.
لکه شرقی (ادامه روش وسترن بلات)
تعریف روش وسترن بلات
روش بر اساسترکیبی از الکتروفورز ژل و
ایمونوشیمیایی
واکنش های "آنتی ژن آنتی بادی"
"فاز جامد" برای ایمونوبلات
مواد متخلخل مانندنیتروسلولز (PVDF) به عنوان
پرکننده ها به صورت حجمی یا به شکل
ورق های صاف یا نوارهای نوار
(نوار انگلیسی) ؛ نوارها در استفاده می شود
روش هایی مانند immunoblot و
ایمونوکروماتوگرافی ؛
در مواد متخلخل ، به طور قابل توجهی
منطقه بزرگتری که روی آن
توسط یکی از شرکت کنندگان سر خورد
فعل و انفعالات؛ سایر معرف ها
از طریق منافذ منتشر می شود
انواع فاز جامد برای وسترن بلات
آماده سازی نمونه
نمونه را می توان از یک قطعه گرفتبافت یا از کشت سلولی در پارچه یک تکه
فرهنگ سلولی
در بیشتر موارد ، بافت سخت
ابتدا به صورت مکانیکی خرد شد
با استفاده از مخلوط کن (برای
نمونه هایی با حجم زیاد) ، با
سنگ زنی مکانیکی
با استفاده از هموژنایزر
(حجم های کمتر) ، یا
فراصوت
مواد شوینده مختلف مواد شوینده ، آسیاب با هموژنایزر
نمک و بافر می تواند باشد
درخواست کرد
بهبود لیز سلولی و
حل پروتئین ها
صوتی سازی
مهار کننده های پروتئاز و فسفاتاز اغلب وجود دارد
o برای جلوگیری جلوگیری می شود
تقسیم نمونه های آنها
سنگ زنی در نیتروژن مایع
آنزیم های خود
آماده کردن بافت اغلب
در سطح پایین انجام شده است
درجه حرارت به
مهار کننده های پروتئاز ، فسفاتازها
اجتناب از تغییر رنگ پروتئین
شرایطی که بهبود می یابد
آماده سازی نمونه
مواد شوینده ، نمک ، بافر
با تکان دادن نمونه ها همگن می شود
در میکرو لوله ها یا کاسه هایی با توپ های سخت
دمای پایین
الکتروفورز ژل. متداول ترین روش برای جداسازی پروتئین ها ، الکتروفورز ژل پلی اکریل آمید در حضور Lammy SDS است
الکتروفورز ژل. اکثرمسیر مشترک
جداسازی پروتئین ها -
الکتروفورز در
ژل پلی اکریل آمید در
حضور SDS توسط لامی
الکتروفورز ژل
الکتروفورز ژلSDS تماس می گیرد
تغییر رنگ پروتئین
و از آنها در
تغییر رنگ داد
شرایط ، برای
تخریب
ثانویه و
ساختارهای سوم
پروتئین استفاده کنید
کاهنده ها
دی سولفید
اتصالات
الکتروفورز ژل
موضوعتجزیه و تحلیل پروتئین در
حضور
دودسیل سولفات
افزایش سدیم
یکسان
منفی
ساخت شارژ
ممکن آنها
تقسیم به
فقط وابستگی ها
از مولکولی
اصل الکتروفورز
مقدماتیپروتئین های تغییر شکل یافته
در جیب "آهنگ" قرار دهید
(آهنگ) ژل آکریل آمید
غلظت کم
(ژل غلیظ) که
به آنها اجازه می دهد تمرکز کنند
قبل از رفتن به
ژل جدا کننده (با بیشتر
غلظت بالا) ، جایی که
جداسازی پروتئین ها رخ می دهد
بسته به مولکولی
توده ها
مهاجرت پروتئین ها به
میدان الکتریکی از طریق
ژل آکریل آمید به آند ،
در حالی که پروتئین ها کمتر هستند
اندازه سریعتر حرکت می کند
اصل الکتروفورز
تفاوت در سرعتترویج -
الکتروفورتیک
تحرک منجر می شود
جداسازی پروتئین ها به نوار
به عنوان یک قاعده ، یکی از
"آهنگ" برای باقی مانده است
نشانگرهای وزن مولکولی
(مخلوطی از پروتئین ها با شناخته شده
توده ها)
ژل های رنگ آمیزی
رنگ آمیزی پروتئین ها درژل های رنگی
کوماسی
رنگ آمیزی پروتئین ها در
ژل های نقره ای
برای تجسم بیشتر نتایج الکتروفورز بیشتر
فقط از رنگ آمیزی پروتئین در ژل ها استفاده کنید
رنگ Coomassie یا نقره
در بیشتر موارد ، نتایج حاصل می شود
جداسازی الکتروفورتیک کافی است
با ارزیابی بصری ژل به دست آورید.
با این حال ، به منظور به دست آوردن داده های معتبر و
مستندسازی مناسب نتایج ژل
با استفاده از یک دستگاه بسیار حساس ، نور را اسکن کنید
تراکم سنج ، که به شما امکان می دهد با اطمینان تعیین کنید که آیا نیست
فقط موقعیت پروتئین ها در ژل ، بلکه نوری نیز وجود دارد
تراکم لکه پروتئین
رنگرزی
غشاء بیشتر
بطرزی قابل اعتماد
تجزیه و تحلیل جداسازی الکتروفورتیک پروتئین ها ، لکه گیری
استفاده از یک نرم افزار اختصاصیشما می توانید پارامترهایی مانند
تحرک الکتروفورتیک یک پروتئین ، آن
پاکیزگی ، میزان پروتئین موجود در لکه و غیره
سیستم شیمی نوری بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد.
تشخیص پروتئین - استفاده از فیلم های اشعه ایکس
(لکه گیری)
استفاده کنید
نرم افزار
برنامه ImageJ
کاربرد سیستم تجسم برای WB (به پایین مراجعه کنید)
تجزیه و تحلیل جداسازی الکتروفورتیک پروتئین ها
تعیین وزن مولکولی پروتئین مورد بررسینیاز به کالیبراسیون ژل توسط
وزن مولکولی ژل را در برابر کالیبره کنید
توده های مولکولی پروتئین های نشانگر که
به طور موازی با نمونه آزمایش تقسیم می شود.
انتخاب٪ ژل حل کننده.
تمرکزآکریل آمید تعریف می کند
مجاز
توانایی ژل - از
غلظت بالاتر
آکریل آمید بهتر است
جدایش، جدایی
وزن مولکولی پایین
پروتئین ها کم
تمرکز
آکریل آمید بهبود می یابد
مجاز
قابلیت الکتروفورز ژل برای
وزن مولکولی بالا
اندازه پروتئین ، kDa
٪ AA
36-205
5%
24-205
7.5%
14-205
10%
14-66
12.5%
10-45
15%
انتقال پروتئین به غشاء برای در دسترس قرار دادن پروتئین ها برای آنتی بادی ها و تشخیص بیشتر ، آنها به همراه یک نوار ژل به غشایی منتقل می شوند
انتقال به غشاءدر دسترس قرار دادن پروتئین ها برای آنتی بادی ها و تشخیص بیشتر ، همراه با یک نوار
ژل به غشایی از نیتروسلولز یا PVDF منتقل می شود.
غشا روی ژل اعمال می شود ،
و یک پشته روی آن قرار دهید
کاغذ فیلتر.
روش انتقال پروتئین
موسوم به الکتروبوتینگ و
از جریان الکتریکی استفاده می کند که
پروتئین ها را از ژل به غشاء منتقل می کند.
پروتئین ها از ژل به سمت دیگر حرکت می کنند
غشاء ضمن حفظ آن
محل. در نتیجه
محو کردن یک فرایند
پروتئین ها روی یک نازک نگه داشته می شوند
لایه سطحی غشاء برای
تشخیص
هر دو نوع غشاء به دلیل خاصیت اتصال غیر اختصاصی مورد استفاده قرار می گیرند
پروتئین ها
اتصال پروتئین بر اساس هر دو است
در مورد فعل و انفعالات آبگریز ، بنابراین
و در مورد الکترواستاتیک
برهم کنش بین غشاء و
پروتئین
غشای نیتروسلولز ارزانتر است
PVDF ، اما بسیار شکننده تر و بدتر است
کاربرد مکرر را تحمل می کند
برچسب ها
انواع لخته شدن الکترولیک
خشکخیس
نیمه خشک
(نیمه خشک)
رنگ آمیزی پروتئین روی فیلتر
مسیررنگ آمیزی
پونسو اس
حساسیت ،
عدد
سنجاب
1-2 میکروگرم
نیتروسلولز
+
نایلون
-
PVDF
+
آمیدو
سیاه
1.5 میکروگرم
+
-
+
کوماسی
آبی
1.5 میکروگرم
+
-
+
جوهر هند
100ng
+
-
+
بیوتیناویدین
30ng
+
+
+
کلوئیدی
طلا
3ng
+
-
+
رنگرزی
برگشت پذیر
ثابت ، کم سابقه
ایستاده ، پس زمینه بلند
دائمی
ثابت ، رنگ پریده با
زمان
دائمی
تأیید انتقال پروتئین به فیلتر (لکه Ponceus)
مسدود کردن
پس از انتخابغشاء ، آنتی بادی های انتخاب شده
و پروتئین مورد نظر باید
اقداماتی که باید انجام شود
حذف تعامل
بین غشاء و
آنتی بادی مورد استفاده برای
تشخیص پروتئین مورد نظر (زیرا
آنتی بادی خود یک پروتئین است).
مسدود کردن
اتصال غیر اختصاصی
به دست آوردن اتاق
غشای رقیق شده
محلول پروتئین - معمولاً این
آب پنیر گاوی
آلبومین یا بدون چربی
شیر خشک یا ژلاتین
با درصد کمی
شوینده نوع Tween-20.
مسدود کردن یکی از این موارد است
مراحل مهم
برگزاری
م effectiveثر غربی
لکه گیری
مکانیسم مسدود کردن
پروتئیناز رقیق شده
ملات به آن متصل است
غشایی در همه مکانها ،
جایی که هدف متصل نشده است
پروتئین بنابراین ، برای
افزودن آنتی بادی ، im
(به آنتی بادی ها) رایگان نیست
در غشا ، در هر کجا
آنها می توانند ضمیمه شوند ،
به جز پیوند دادن سایت ها در
هدف خاص
پروتئین ها این پیشینه
"سر و صدا" در فینال
محصول وسترن بلات
منجر به تمیز شدن می شود
نتایج و
استثنا غلط است
تشخیص WB غیر مستقیم و مستقیم
فوایدآنتی بادی ثانویه سیگنال را افزایش می دهد (چندین ثانویه
آنتی بادی ها می توانند به یک ماده اولیه متصل شوند)
طیف گسترده ای از آنتی بادی های ثانویه موجود است
می توان از یک آنتی بادی ثانویه استفاده کرد
تشخیص آنتی بادی های مختلف
اتصال به برچسب آنزیمی آنتی بادی ثانویه نیست
بر روی واکنش ایمنی آنتی بادی اولیه تأثیر می گذارد
جایگزینی آنتی بادی ثانویه می تواند تغییر کند
روش تشخیص
محدودیت ها
آنتی بادی های ثانویه باعث ایجاد محل می شوند
صحافی غیر اختصاصی
مراحل تکمیلی کار
فواید
فقط نیاز به استفاده
آنتی بادی های اولیه ، که روند را تسریع می کند
توانایی استفاده از اولیه
آنتی بادی هایی با برچسب های مختلف
معایب
اتصال به برچسب آنزیمی
ممکن است واکنش ایمنی را کاهش دهد
آنتی بادی اولیه
هزینه بالای آنتی بادی های اولیه
مشکل انتخاب آنتی بادی و کم است
علامت
تشخیص مرحله بعدی واکنش اتصال پروتئین مورد مطالعه با یک آنتی بادی خاص (اولیه) است.
محلول و غشای آنتی بادیمی تواند با هم بسته شود و
از 30 دقیقه انکوبه می شود
قبل از ترک یک شبه
آنها همچنین می توانند باشند
انکوباتور در
دمای مختلف ،
با افزایش یافته است
دما مشاهده می شود
صحافی بهتر
پس از حذف
اولیه نامربوط
آنتی بادی ، غشاء
با ثانویه مقاومت کند
آنتی بادی ها و مطابق آن
با ویژگی های هدف خود ،
معمولاً توسط
آنتی بادی های وسترن بلات. مکانیزم تشخیص
آنتی بادی ها ازمنبع حیوانی و
مخاطب
اولیه ترین
آنتی بادی ثانوی
آنتی بادی ها معمولاً متصل می شوند
قلیایی فسفاتاز یا
پراکسیداز ترب کوهی
اکثر
مشترک،
مربوط به پراکسیداز
آنتی بادی ثانویه ترب کوهی
استفاده برای
برش دادن
کم نور
عامل و محصول واکنش
شب تاب تولید می کند
تابش متناسب است
مقدار پروتئین
ورق حساس به نور
فیلم عکاسی
متناسب با غشا
و افشا شد
واکنش تابشی ، ایجاد
تصویر نوارهای آنتی بادی روی
لکه
ارزان تر اما کمتر
رویکرد حساس با
با استفاده از رنگ آمیزی 4 کلرونفتول
مخلوط با 1 per پراکسید
هیدروژن ، که رنگ قهوه ای تیره می دهد ،
که بدون آن ثبت شده است
استفاده از ویژه
فیلم عکاسی
یک روش تشخیص دیگر
آنتی بادی های ثانویه
از آنتی بادی با استفاده می کند
فلوروفور مرتبط ،
که در داخل تابش می کند
نزدیک مادون قرمز
منطقه (NIR) سبک،
منتشر شده
فلورسنت
رنگ ، دائمی و
فلورسنت می کند
تشخیص دقیق تر و
به روشی حساس
اندازه گیری تفاوت در
سیگنال تولید شده
پروتئین هایی که دارای برچسب هستند
آنتی بادی ، غربی
لکه
تشخیص سایر روشهای تشخیص
جایگزین سومروش استفاده می کند
برچسب رادیواکتیو
به جای آنزیم ،
مرتبط با ثانویه
آنتی بادی (با
ایزوتوپ رادیواکتیو
ید) روشهای دیگر
ایمن تر ، سریعتر و
ارزان تر ، بنابراین
تشخیص رادیواکتیو
به ندرت استفاده می شود
تجسم.
تجسمانجام شده با
با کمک مستندسازی ژل
سیستم ها یا دیجیتال
دوربین.
ارائه فیلم
تکنولوژی بدون لکهدر عمل ، نه همه
وسترن کشف می کند
پروتئین ها فقط در یک زمان
روی غشاء
اندازه تقریبی
با مقایسه محاسبه کنید
نوارهای رنگی با
نشانگرهای مولکولی
توده های اضافه شده در
الکتروفورز
این روند با
پروتئین های ساختاری ،
مانند اکتین یا
tubulin که نیستند
تغییر بین
آزمایش. تعداد
پروتئین مورد نظر بستگی دارد
تعداد کنترل
پروتئین ساختاری بین
در گروه. این ترفند
اصلاح را ارائه می دهد
مقدار پروتئین کل در هر
غشاء در صورت بروز خطا
تجزیه و تحلیل و ارائه نتایج.
استفادهنرم افزار
برنامه های کاربردی تصویر
ج.
از برنامه
برنامه BioRad IHC
ایمنی
فلورسانس
فیلم وسترن
لکه گیری
کاربرد روش
وسترن بلاتاستفاده شده توسط
در مولکولی
بیولوژی ، بیوشیمی ، ژن
تیک و دیگران
علوم طبیعی
رشته ها
در پزشکی:
تشخیص HIV
بیماری (ایدز)
آهک ، هلیکوباکتر
پیلوری ، ویروس اپشتین بار
پروتکل کامل
1. الکتروفورز2. انتقال
3. مسدود کردن
4. جوجه کشی با
آنتی بادی اولیه
5. شستشو
6. جوجه کشی با
آنتی بادی ثانویه
7. شستشو
8. پردازش
کم نور
سیستم تشخیص
9. تشخیص با استفاده از
فیلم اشعه ایکس
10. تجزیه و تحلیل
کاربرد در طب عملی
تائیدیهعفونت HIV
تشخیص های ناشی از کنه
بورلیوز (بیماری لایم)
تشخیص سیاه زخم
تشخیص توکسوپلاسموز
(T) ؛
گروهی از عفونت ها -
هپاتیت ، سفلیس ،
کلامیدیا ، لیستریوز و غیره
(O) ؛
سرخجه (R) ؛
سیتومگالوویروس
عفونت (C) ؛
تبخال (H)
ویروس اپشتین بار
در این حالت ، غشاهای نوار تست با روکش پوشانده می شوند
فقط
از نظر بالینی
قابل توجه
آنتی ژن ها
(بومی ،
مصنوعی یا نوترکیب) به طور خاص
باشه. این روش برای دیفرانسیل استفاده می شود
تشخیص چندین عفونت در یک نوار
عمومی.
1) انتقال پروتئین از ژل به غشاء ؛
2) انسداد جذب غیر اختصاصی ؛
3) جذب آنتی بادی های I ؛
4) شستشو ؛
5) جذب آنتی بادی II ؛
6) شستشو ؛
7) توسعه فیلتر ؛
نقاط.
هیبریداسیون
- همه کارها را با NT روی سکوی گهواره ای انجام دهید ، هیبریداسیون و گرفتگی در کیسه های سلفون (محلول V ~ 1.5 میلی لیتر ، بسته به اندازه فیلتر) ، شستشو در حمام:
- مسدود کننده: 3٪ پودر شیر ، 1x PBS ، 30-40 "؛
- "I" a / t: 1h 0.3٪ پودر شیر ، 1x PBS ، آنتی سرم ؛
- 3 بار در 5 اینچ شستشو دهید: 1x PBS ، 0.05٪ Tween-20 ؛
- "II" a / t: 30 "در 1x PBS ؛
- شستشو مانند بند 3
- شستشو و رانندگی در حمام انجام می شود. هیبریداسیون: یک قطعه پارافیلم (غشاء بیشتر) را روی میز بگذارید ، روی آن - 0.5-1 میلی لیتر محلول هیبریداسیون با a / t. غشاء را با طرف (P) رو به روی محلول قرار دهید ، از ایجاد حباب اجتناب کنید و قسمت بالایی را با یک قطعه پارافیلم به اندازه غشا بپوشانید. به مدت 1 ساعت انکوبه کنید.
علیرغم محتوای بسیار کمتر پودر شیر در بافر هیبریداسیون برای "I" a / t و عدم وجود کامل آن در بافر برای "II" a / t ، این روش تصاویر واضحی را ارائه می دهد. ظاهراً موفقیت با وسایل نقلیه استفاده شده تعیین می شود.
این روش حجم مخلوط هیبریداسیون را کاهش می دهد ، اما ممکن است کیفیت هیبریداسیون را کاهش دهد.
